日韩亚洲AV人人夜夜澡人人爽_91在线看片福利无码_亚洲一区二区无码中文字幕日_国产精品扒开腿做爽爽爽的小说,男JI大巴进入女人的直播_男女无遮挡XX00动态图120秒_自拍偷区亚洲综合激情_中文字日产乱码六区中国有限公司/国产超碰人人模人人爽人人添/久久精品www人人爽人人

想提高PCR特異性嗎?用對(duì)酶很重要!

作者:康潤(rùn)生物
發(fā)布時(shí)間:2022-12-12
1682次瀏覽

隨著常規(guī)PCR技術(shù)在分子生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,非特異性擴(kuò)增等現(xiàn)象也經(jīng)常出現(xiàn),造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確性。


非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生和影響

普通的Taq DNA 聚合酶的最適溫度是72℃,此時(shí)酶的活性最佳,低于此溫度,酶有較弱活性。在PCR擴(kuò)增的升溫過(guò)程中,酶發(fā)揮較弱的活性,體系極易錯(cuò)配或形成引物二聚體,尤其是當(dāng)設(shè)計(jì)的引物3’端是G 或C,錯(cuò)配的鏈很難重新解開(kāi)。非特異性擴(kuò)增正是由于DNA聚合酶低溫下具有活性而引起的錯(cuò)誤引導(dǎo)靶標(biāo)延伸和引物二聚體形成的。


非特異性擴(kuò)增的具體影響包括:

  • 目標(biāo)擴(kuò)增子產(chǎn)量低;

  • 目標(biāo)擴(kuò)增子的靈敏度下降;

  • 下游應(yīng)用效果不佳。

因此,要提高PCR 擴(kuò)增的特異性和降低反應(yīng)錯(cuò)配率,可以人為的控制酶的活性,在72℃之前讓酶不發(fā)揮活性,這樣就避免了在升溫(或配置反應(yīng)體系)過(guò)程中發(fā)生鏈的錯(cuò)配,從而保證擴(kuò)增的特異性。

而目前最常用的提高PCR特異性的方法是使用熱啟動(dòng)型Taq DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增,即熱啟動(dòng)PCR。


熱啟動(dòng)PCR  

熱啟動(dòng)PCR,主要利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性,加熱到變性溫度時(shí)修飾物失活,酶活得以釋放,從而使PCR反應(yīng)正常進(jìn)行。

熱啟動(dòng)PCR的優(yōu)勢(shì):

  • 阻止引物與低同源性的模板序列結(jié)合;

  • 在PCR反應(yīng)開(kāi)始之前,防止引物與引物之間形成引物二聚體;

  • 提高目的片段的擴(kuò)增靈敏度和產(chǎn)量;

  • 可在室溫下配制反應(yīng)體系和設(shè)置反應(yīng)程序,使操作更為便利,且不會(huì)影響擴(kuò)增性能和特異性。

熱啟動(dòng) Taq DNA聚合酶的修飾方法

熱啟動(dòng)Taq DNA 聚合酶常用的修飾方法有化學(xué)修飾法、抗體法和配體修飾法等。其中化學(xué)修飾法和抗體法最為常用。雖然它們都能抑制室溫下的聚合酶活性,但兩者之間存在一些差異。

化學(xué)修飾法

化學(xué)修飾法熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶:一般采用化學(xué)小分子,如酸酐,與聚合酶上的氨基酸基團(tuán)(賴(lài)氨酸)結(jié)合,使酶低溫時(shí)失去酶活。加熱至特定溫度和時(shí)間后,化學(xué)小分子與氨基酸之間的化學(xué)鍵斷裂,酶活釋放,從而達(dá)到熱啟動(dòng)效果?;瘜W(xué)修飾可有效封閉酶的活性,操作簡(jiǎn)單,酶活性釋放速度較慢,酶活性維持更加穩(wěn)定且無(wú)任何外源DNA污染,性?xún)r(jià)比更高。

但是,酶激活時(shí)間較長(zhǎng)可能會(huì)影響酶的活性,導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量降低。


檸康酸酐與酶結(jié)合的原理

一般認(rèn)為Taq DNA聚合酶上賴(lài)氨酸基團(tuán)有42個(gè)左右,但是由于空間結(jié)構(gòu)限制,其中一部分賴(lài)氨酸基團(tuán)在基團(tuán)內(nèi)部,無(wú)法與化學(xué)修飾基團(tuán)相結(jié)合。

抗體法

抗體法熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶:一般使用Taq DNA聚合酶抗體,在PCR反應(yīng)高溫加熱前,抗體與DNA聚合酶結(jié)合,封閉酶活性。在加熱至變性溫度時(shí)抗體變性,解除封閉從而釋放酶活性。此外,抗體型熱啟動(dòng)酶由于酶活釋放速度快,可大大降低PCR反應(yīng)時(shí)間,且具有更高的靈敏度和擴(kuò)增效率。

但其缺點(diǎn)是抗原抗體結(jié)合是一種動(dòng)態(tài)平衡,試劑配比優(yōu)化時(shí)間長(zhǎng)。

640 (2).png

抗體與DNA聚合酶特異性結(jié)合封閉原理示意圖

兩種熱啟動(dòng)修飾方法的比較

640 (3).png

優(yōu)質(zhì)的熱啟動(dòng) Taq DNA聚合酶


熱啟動(dòng)PCR目前的應(yīng)用已是非常廣泛,在較難擴(kuò)增的PCR反應(yīng)如基因組DNA、單拷貝序列的擴(kuò)增、多重PCR和超長(zhǎng)片段的擴(kuò)增中的應(yīng)用尤為突出。

優(yōu)質(zhì)的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶,能有效降低或消除非特異性產(chǎn)物以及引物二聚體的形成,提高引物與模板結(jié)合的效率。進(jìn)一步提高目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物量,使PCR反應(yīng)更趨于完美。

GenStar相關(guān)產(chǎn)品

HotStart Taq DNA Polymerase(Cat#A131)

  • 靈敏快速:抗體修飾熱啟動(dòng)酶,擴(kuò)增靈敏度更高,反應(yīng)速度快;

  • 性能優(yōu)異:擴(kuò)增效率高,重復(fù)性好,跨度均一;

  • 兼容性強(qiáng):適用于各種PCR或qPCR反應(yīng)體系。

HotStart Power Taq DNA Polymerase(Cat#A135)

  • 特異性強(qiáng):化學(xué)修飾熱啟動(dòng)酶,酶活封閉更完全,有效抑制非特異性擴(kuò)增;

  • 性能穩(wěn)定:95℃加熱10 min,徹底釋放酶活性;

  • 適合復(fù)雜模板:適用于從復(fù)雜模板中擴(kuò)增低拷貝基因。

產(chǎn)品列表

640 (4).png

主要參考資料:

Saiki RK,Scbarf S,F(xiàn)aloona F,el a1.Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site anaylisis for diagnosis of sickle cell anemia[J].Science,1985,230(4732):1350-1354.

W ang Y,Prosen DE,Mei L,et al A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivlty and improved performance in vitro[J] Xucleic Acids Research,2004;32(3):1197-1207.

Hiroshi M, et al. Characterization and Application to Hot Start PCR of Neutralizing Monoclonal Antibodies against KOD DNA Polymerase. [J].Synthetic Chemistry and Biological Chemistry.1999, 126(4):762.

周曉薇,朱雪蛟,田玲,等.耐熱Taq DNA聚合酶的酸酐修飾及其在降低PCR非特異性擴(kuò)增中的應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,23(3):500—505.


孟连| 威宁| 芷江| 永宁县| 武义县| 阳春市| 岗巴县| 鹤庆县| 化州市| 京山县| 永新县| 高雄市| 淅川县| 白城市| 澄城县| 习水县| 萍乡市| 滕州市| 金昌市| 屯留县| 七台河市| 开封县| 淮北市| 延川县| 翼城县| 繁昌县| 六安市| 樟树市| 桦川县| 永吉县| 石河子市| 三河市| 靖宇县| 景东| 宣城市| 大埔区| 文登市| 明星| 青岛市| 天峻县| 灌南县|