隨著常規(guī)PCR技術(shù)在分子生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，非特異性擴(kuò)增等現(xiàn)象也經(jīng)常出現(xiàn)，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確性。
非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生和影響
普通的Taq DNA 聚合酶的最適溫度是72℃，此時(shí)酶的活性最佳，低于此溫度，酶有較弱活性。在PCR擴(kuò)增的升溫過(guò)程中，酶發(fā)揮較弱的活性，體系極易錯(cuò)配或形成引物二聚體，尤其是當(dāng)設(shè)計(jì)的引物3’端是G 或C，錯(cuò)配的鏈很難重新解開(kāi)。非特異性擴(kuò)增正是由于DNA聚合酶低溫下具有活性而引起的錯(cuò)誤引導(dǎo)靶標(biāo)延伸和引物二聚體形成的。
非特異性擴(kuò)增的具體影響包括：
目標(biāo)擴(kuò)增子產(chǎn)量低；
目標(biāo)擴(kuò)增子的靈敏度下降；
下游應(yīng)用效果不佳。
因此，要提高PCR 擴(kuò)增的特異性和降低反應(yīng)錯(cuò)配率，可以人為的控制酶的活性，在72℃之前讓酶不發(fā)揮活性，這樣就避免了在升溫（或配置反應(yīng)體系）過(guò)程中發(fā)生鏈的錯(cuò)配，從而保證擴(kuò)增的特異性。
而目前最常用的提高PCR特異性的方法是使用熱啟動(dòng)型Taq DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，即熱啟動(dòng)PCR。
熱啟動(dòng)PCR
熱啟動(dòng)PCR，主要利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性，加熱到變性溫度時(shí)修飾物失活，酶活得以釋放，從而使PCR反應(yīng)正常進(jìn)行。
熱啟動(dòng)PCR的優(yōu)勢(shì)：
阻止引物與低同源性的模板序列結(jié)合；
在PCR反應(yīng)開(kāi)始之前，防止引物與引物之間形成引物二聚體；
提高目的片段的擴(kuò)增靈敏度和產(chǎn)量；
可在室溫下配制反應(yīng)體系和設(shè)置反應(yīng)程序，使操作更為便利，且不會(huì)影響擴(kuò)增性能和特異性。
熱啟動(dòng) Taq DNA聚合酶的修飾方法
熱啟動(dòng)Taq DNA 聚合酶常用的修飾方法有化學(xué)修飾法、抗體法和配體修飾法等。其中化學(xué)修飾法和抗體法最為常用。雖然它們都能抑制室溫下的聚合酶活性，但兩者之間存在一些差異。
化學(xué)修飾法
化學(xué)修飾法熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶：一般采用化學(xué)小分子，如酸酐，與聚合酶上的氨基酸基團(tuán)（賴(lài)氨酸）結(jié)合，使酶低溫時(shí)失去酶活。加熱至特定溫度和時(shí)間后，化學(xué)小分子與氨基酸之間的化學(xué)鍵斷裂，酶活釋放，從而達(dá)到熱啟動(dòng)效果?；瘜W(xué)修飾可有效封閉酶的活性，操作簡(jiǎn)單，酶活性釋放速度較慢，酶活性維持更加穩(wěn)定且無(wú)任何外源DNA污染，性?xún)r(jià)比更高。
但是，酶激活時(shí)間較長(zhǎng)可能會(huì)影響酶的活性，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量降低。
檸康酸酐與酶結(jié)合的原理
一般認(rèn)為Taq DNA聚合酶上賴(lài)氨酸基團(tuán)有42個(gè)左右，但是由于空間結(jié)構(gòu)限制，其中一部分賴(lài)氨酸基團(tuán)在基團(tuán)內(nèi)部，無(wú)法與化學(xué)修飾基團(tuán)相結(jié)合。
抗體法
抗體法熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶：一般使用Taq DNA聚合酶抗體，在PCR反應(yīng)高溫加熱前，抗體與DNA聚合酶結(jié)合，封閉酶活性。在加熱至變性溫度時(shí)抗體變性，解除封閉從而釋放酶活性。此外，抗體型熱啟動(dòng)酶由于酶活釋放速度快，可大大降低PCR反應(yīng)時(shí)間，且具有更高的靈敏度和擴(kuò)增效率。
但其缺點(diǎn)是抗原抗體結(jié)合是一種動(dòng)態(tài)平衡，試劑配比優(yōu)化時(shí)間長(zhǎng)。
抗體與DNA聚合酶特異性結(jié)合封閉原理示意圖
兩種熱啟動(dòng)修飾方法的比較
優(yōu)質(zhì)的熱啟動(dòng) Taq DNA聚合酶
熱啟動(dòng)PCR目前的應(yīng)用已是非常廣泛，在較難擴(kuò)增的PCR反應(yīng)如基因組DNA、單拷貝序列的擴(kuò)增、多重PCR和超長(zhǎng)片段的擴(kuò)增中的應(yīng)用尤為突出。
優(yōu)質(zhì)的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，能有效降低或消除非特異性產(chǎn)物以及引物二聚體的形成，提高引物與模板結(jié)合的效率。進(jìn)一步提高目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物量，使PCR反應(yīng)更趨于完美。
GenStar相關(guān)產(chǎn)品：
HotStart Taq DNA Polymerase（Cat#A131）
靈敏快速：抗體修飾熱啟動(dòng)酶，擴(kuò)增靈敏度更高，反應(yīng)速度快；
性能優(yōu)異：擴(kuò)增效率高，重復(fù)性好，跨度均一；
兼容性強(qiáng)：適用于各種PCR或qPCR反應(yīng)體系。
HotStart Power Taq DNA Polymerase（Cat#A135）
特異性強(qiáng)：化學(xué)修飾熱啟動(dòng)酶，酶活封閉更完全，有效抑制非特異性擴(kuò)增；
性能穩(wěn)定：95℃加熱10 min，徹底釋放酶活性；
適合復(fù)雜模板：適用于從復(fù)雜模板中擴(kuò)增低拷貝基因。
產(chǎn)品列表
主要參考資料:
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